Die Diagnose eines primären Hyperparathyreoidismus ist leicht zu stellen. In der Regel fällt dem behandelnden Arzt zunächst die Erhöhung des Calciumspiegels auf. Leider wird einem erhöhten Calciumspiegel oft nicht die notwendige Bedeutung beigemessen. Schon geringfügige Erhöhungen sind krankhaft, denn der Calciumspiegel wird sehr genau reguliert. Wird bei einem erhöhten Calciumspiegel auch ein erhöhter oder hoch normaler Parathormonspiegel nachgewiesen, so ist die Diagnose einer primären Nebenschilddrüsenüberfunktion nahezu gesichert. Lediglich eine seltene familiäre Erkrankung (familiäre hypocalcurische Hypercalcämie, fhH) kann neben einer Nebenschilddrüsenüberfunktion diese Laborkonstellation hervorrufen.

Zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Krankheitsbildern wird die Calciumausscheidung im Urin gemessen, die bei der Nebenschilddrüsenüberfunktion normal oder erhöht ist, während sie bei der fhH erniedrigt ist. Um festzustellen, welche Nebenschilddrüse vergrößert ist und wo diese liegt, kann eine sog. Lokalisationsdiagnostik durchgeführt werden. Hierzu wird als erste Maßnahme eine Ultraschalluntersuchung durchgeführt. Eine weitere sehr gute Untersuchungsmethode ist die Nebenschilddrüsenszintigraphie. In seltenen Fällen wird auch die Computertomographie oder die Kernspintomographie eingesetzt, deren Ergebnisse jedoch weniger gut als die der Szintigraphie und der Ultraschalluntersuchung sind.

Nur ganz selten wird ein sog. Stufenkatheter mit Blutentnahmen aus verschiedenen Venen im Hals- und Brustkorbbereich durchgeführt. Durch die Bestimmung des Parathormonspiegels in diesen Blutproben können dann Rückschlüsse auf die Lokalisation der vergrößerten Nebenschilddrüse gezogen werden. Diese Untersuchungen werden insbesondere durchgeführt, um die vergrößerte Nebenschilddrüse möglicherweise über einen sehr kleinen Schnitt entfernen zu können. Bis vor wenigen Jahren war dies noch nicht möglich, so dass immer aller vier Nebenschilddrüsen aufgesucht und die vergrößerte Drüse entfernt wurde. Deshalb war bis vor wenigen Jahren eine Lokalisationsdiagnostik nicht erforderlich.

In seltenen Fällen liegt eine sog. Vierdrüsenhyperplasie (Erkrankung aller vier Nebenschilddrüsen) vor. Es muss dann auch an vererbbare Formen der Nebenschilddrüsenüberfunktion gedacht werden. Noch seltener sind sog. Doppeladenome.